(内蒙古科技大学 生物与化学工程学院，内蒙古 包头 014010)
摘 要：文章就牛奶中抗生素残留的几种检测方法做了一个系统综述，介绍了普通方法、色谱法、免疫法、牛乳发酵活性实验法、Benedict试剂法、DELVOTEST检测法、Deivoteur p试剂等方法。提出，其中色谱法、免疫法及其联用技术在残留分析方面的研究与应用取得了长足进展，在抗生素残留快速检测中效果明显。
关键词：牛奶；抗生素；检测
中图分类号：TS207 文献标识码：A 文章编号：1007—6921(2009)02—0077—03
牛奶中抗生素残留问题在世界范围内一直没有被彻底攻克，已成为行业发展以及食品安全的隐患之一。抗生素主要指能抑制或杀死其他微生物的一类化学物质，如青霉素、四环素、金霉素、链霉素、氯霉素、磺胺类药物等。在医学上，抗生素被广泛的应用于预防和治疗多种微生物感染性疾病以及某些癌症。在奶业的源头中，抗生素使用频率很高，特别是治疗牛乳房炎，常常大剂量反复使用。据统计，约有十多种抗生素以一种或多种联合的形式采用粉剂、涂擦剂、注射剂，以及乳导管注入等方式加以应用，导致抗生素残留相当严重，在奶牛饲料中，也含有抗生素添加剂。.gif)
目前，国内外用于检测奶及奶制品中抗生素残留的方法很多，而为满足奶及奶制品生产需要和遵守新法规，人们对快速检测开始感兴趣，而高效液相色谱法、酶联免疫吸附测定法等方法具有最低检出限量低、准确性好、灵敏性强、重现性好的特点，成为残留分析的主流。
1 牛奶中抗生素的弊处
牛奶中不允许残留抗生素，主要有两个原因：
第一，占人口一定比例的人对抗菌素尤其是青霉素过敏，人们长期饮用或食用抗生素残留的牛奶或奶制品，也就相当于长期低剂量的摄取抗生素，其危害性主要有：①使人体产生耐药性，给今后患病使用抗生素治疗带来不良影响；②抗生素对过敏体质的人会出现过敏反应，危及健康；③破坏人体内正常菌群的平衡状态，使菌群失调，甚至造成二重感染，使重症患者病情难以控制。
第二，发酵奶制品（酸奶和干酪）的生产依赖于乳酸菌的生长，而乳酸菌的生长受抗菌素的强烈抑制，常导致发酵失败。
2 普通方法检测牛奶中抗生素［2］
2.1 枯草杆菌纸片检测法
将以吸满受检奶样的滤纸圆片放入一接种枯草杆菌的琼脂平皿上，并放入一含有标准抗生素的阳性对照圆片。将陪替氏培养皿在32℃下培养17～24h，然后观察有无抑菌圈的出现。如在奶样圆片周围有明显的抑菌圈，则判定结果为阳性。为确定其结果是否为真阳性，则须将奶样在82℃下加热2～3min，冷却，再重复实验。加热处理旨在消除自然产生的抑菌性物质的干扰作用，因而可减少假阳性结果的产生。为了确定阳性物质是否为青霉素（或β-内酰胺类），对加热后的奶样用青霉素酶处理，以灭活奶样中的青霉素。然后再进行检测，如原来有抑菌作用的奶样不再产生抑菌圈，则证明奶中存在青霉素。如果仍产生抑菌圈,则该抑菌作用是由其他抑菌化合物所致。如果抑菌圈小，但是尚未完全消失，则说明存在不止一种抑菌化合物。该筛选方法的检测限为0.01IU/ml。
2.2 溴甲酚紫比色定性检测法
溴甲酚紫比色定性检测法全称微细菌抑制定性比色检验法（colormetric bacterial inhibition test）。此法可用于检测奶中β-内酰胺类抗生素。本试验是根据嗜热脂肪杆菌的变种calidolactis的快速生长，以及在其生长过程中同时产生酸的特点而设计的。
如果样片中不存在抗菌物质，或抑菌物质的浓度不足以抑制微生物的生长，则在培养基中会产生酸。如果样品中的抑菌物质浓度足以抑制细菌的生长，则在培养基中不会产生酸。酸的产生与否可用溴甲酚紫染料来指示。该染料在酸性基质中既变为黄色。本法对β-内酰胺类抗生素特别敏感，但不能用于检测其他抗生素。在进行样品检测时，需用不含抑菌剂的牛奶（空白样品）配置一系列青霉素标准溶液，其浓度分别为0.002、0.004、0.008、0.010IU/ml。
2.3 Charm检测法
Charm检测法全称为磺胺药残留Charm抑菌检测法（Charm inhibition assay for sulfonamide residues），其原理与上述溴甲酚紫比色定性检测法相同。基本操作过程为：取滤纸圆片，分别吸满受检奶样、含对氨基苯甲酸的奶样、含青霉素酶的奶样、阴性对照奶样和阳性对照奶样，然后将圆纸片放在含指示染料和接种嗜热脂肪芽孢杆菌的培养基上，在64±1℃下培养3h20min，观察比较各圆纸片颜色的变化。结果判定方法如下：阴性对照样品显示黄色，表明无抑菌作用。阳性对照样品显示明亮的紫色，其抑菌圈直径为15～20mm。若受检奶样的抑菌圈直径≥阳性对照样品的抑菌圈，则结果为阳性。若含对氨基苯甲酸的奶样不产生抑菌圈，则受检奶样中含磺胺类药物残留。若含青霉素酶的奶样不产生抑菌圈，则受检样品中含β-内酰胺类抗生素。本测定方法至少能检测≤10ppb的磺胺二甲嘧啶和磺胺间二甲氧嘧啶。
3 色谱法检测牛奶中抗生素
色谱学（Chromatography）是现代分析科学的一个重要分支，是最重要和应用最广泛的分离分析方法，在抗生素检测中也是使用最多的一种检测方法。色谱体系中通常包括被分离组分、固定相和流动相，其原理是根据不同组分在两相之间分配系数的差异，当两相做相对运动时组分在两相中反复进行分配，分配次数达到几千次甚至几百万次，即使这些组分的分配系数只有微小差异，随着流动相的流动，不同组分移动距离的差异越来越明显，从而使这些组分得到分离。现代色谱的操作使在仪器上完成的，主要包括色谱柱、检测器、泵和数据处理装置等基本单元。根据流动相和固定相（或色谱柱）的不同，色谱法可分为气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）、薄层色谱法（TLC）、超临界流体色谱法（SFC）、毛细管电泳（CE）等，其中高效液相色谱法（HPLC）、薄层色谱法（TLC）应用最为普遍［3］。
3.1 高效液相色谱的应用
高效液相色谱法是色谱法中使用频率最高的一种检测方法，受到广大科研人员和企业的一致认可。譬如氯霉素残留的检测，氯霉素是一种预防家畜革兰氏阴性感染的有效抗生素，在奶牛生长发育各个阶段都有可能被奶农使用，尤其是在奶牛哺奶期，减少奶牛疾病的同时却增加了氯霉素在牛奶中的残留量。通过采用乙酸乙酯等有机试剂萃取，氯霉素提取物溶解于氯仿中，然后以水—甲醇作流动相，用紫外检测器进行高效液相色谱法的测定，便可以求出样品中氯霉素含量。本方法简单、快捷，只要具有抗生素标准品，同样适用于牛奶及奶制品中其他抗生素残留量检验。
3.2 薄层色谱的应用
该方法主要是将要分离的牛奶或奶制品点在用固定相均匀涂布的薄板下端，然后将薄板斜插在盛有溶剂（也叫展开剂）的层析缸中，使溶剂进入一部分固定相。由于毛细作用，被分离组分随展开剂以不同速度向上移动。由于固定相对混合试样中各组分的吸附力大小不同，各组分会选择性地保留在原点和展开剂前沿之间的固定相上，取出层析板晾干，用显色剂与分离组分反应显出有色（或荧光）斑点。
各组分在板上的位置用Rf值（原点值样品斑点之间的距离/原点至溶剂前沿的距离）表示，当Rf=0时，即样品留在原点，在薄层上没被展开；当Rf=1时，表示样品不被保留，随展开剂展开值样品前沿。合适的Rf值应在0.2～0.8。由于不同薄层板之间的差异及操作条件的细微变化，不同薄层板之间得到的结果会略有差异，因此通常样品的分离鉴定，都采用同一块薄层板上平行滴加抑制样和位置样，在同一条件下展开，进行对照定性［4］。
3.3 其他色谱的应用
超临界流体色谱（SFC）和毛细管区域电泳法（CZE）等方法也被应用于抗生素残留的检测中，这些方法尽管在残留检测中不常用但因其各自特有的性能，能弥补常用方法中不足之处。SFC可弥补气相色谱法（GC）和高效液相色谱法（HPLC）的不足，方便的连接各种灵敏检测器，CZE是90年代以来研究最活跃的分析技术之一，兼有高压电泳的高速、高分辨和HPLC灵活、高效的优点，柱效高达105塔板/m。CZE将在简化样本前处理、多残留分析和分析自动化方面发挥重要作用。目前CZE的主要问题是样品量太小，限制了检验的灵敏度。CZE-MS可能是最好的解决办法。另外，随着接口技术的显著改进，质谱作为一种质量流速型检测器，已经广泛应用于抗生素残留分析检测中。电化学检测器也已用于检测邻氯青霉素、头孢菌素和青霉素。
4 免疫分析法
目前有关免疫分析方法的药物残留免疫分析技术主要分为两大类：一为相对独立的分析方法，即免疫测定法（immunoassays,IAS）如：RIA、ELISA、固相免疫传感器等；二是将免疫分析技术与常规理化分析技术联用，如利用免疫分析的高选择性作为理化检测技术中的净化手段，典型的方式为免疫亲和色谱（immunoaffinity chromatography,IAC）。与常规的理化分析相比免疫分析技术突出的优点是：操作简单，速度快，分析成本低。以使用微量滴板的ELISA为例，免疫测定法取样量少，前处理简单、容量大、仪器化程度低、检测奶与GC/MS或GC/ECD相似，可方便的达到Ng/g～Pg/g级，分析效率则为HPLC或GC的几十倍以上［5］。酶联免疫吸附测定（ELISA）灵敏度高、特异性强、设备简单、操作简便及对人无害等优点，作为一项基本免疫测定技术近来迅速发展，在多领域推广运用［6-8］，但动物性食品中磺胺甲基嘧啶残留ELISA的测定比较少。
5 牛乳发酵活性试验
在无抗生素残留的牛奶中加入酸牛奶或发酵剂，呈正常发酵，奶的pH值迅速下降；如牛奶中有抗生素残留，则发酵剂生长受到抑制，奶的pH值下降变化不大。根据介绍，当牛奶中的抗生素残留达到0.215～0.05IU/ml时，就会抑制乳酸菌发酵，因此生产时间中常采用做小样的办法判断原料奶中是否有抗生物残留。90min后pH值下降至5.7或更低，则为发酵活性试验正常，可判断为阴性，无抗生素残留；如3次测定pH值下降缓慢或不下降，90min时pH值仍在5.7以上，则为有抗生素残留，可判断为阳性［9］。
6 Benedict试剂法
青霉素与Benedict试剂反应显红色,是因为青霉素具有还原性,其分子中含有自由的酮基(>C=0),其酮基可将Benedict试剂中的Cu2+还原成Cu+, Cu+以红色Cu2O的形式存在与牛奶中,即Cu2+→Cu2O↓(砖红色)。如果牛奶青霉素多, Cu2O产生得多,静止试管,可观察到砖红色的Cu2O沉淀。所以，含青霉素的牛奶，加入Benedict试剂后，煮沸5分钟，可因试管内含有青霉素量的多少不等而呈现深红、红、红黄、橘黄、浅橘黄、正黄等颜色［10］。
7 DeivoteuR.P试剂法
对每天所取奶样进行药物残留试验，同时对曾使用过抗生素药物进行治疗的牛只停药3天后，取其奶进行检验；对阳性牛的奶另行处理，阴性牛可上机挤奶。用DeivoteuR P试剂，按量吸取奶样于试剂中，60℃水浴2.5h，进行判定，试剂不变色为阳性，试剂变黄色为阴性，变色不完全为可疑，可疑牛只继续取样送检。
8 结束语
牛奶及奶制品中的抗生素问题一直是一个敏感的话题，国际和国家标准中已做了明确规定。但是现实生产环节中，抗生素残留问题的确存在，且潜在的危害着广大消费者的健康。这就要求我们今后大力开发非抗生素类添加剂；建立和完善快速有效的检测方法；行业内严格按照标准收购、生产、销售牛奶及奶制品，杜绝不符合标准的奶流入市场；提高我国奶品的质量，符合WTO的质量技术要求，提高奶品企业自身产品的竞争力，促进我国奶业向国际化方向发展。
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［4］ 李俊锁，邱月明，王超．兽药残留分析［M］．上海：上海科学技术出版社，2002.141.
［5］ 李俊锁，邱月明，王超．兽药残留分析［M］．上海：上海科学技术出版社，2002156 .
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［9］ 张丹凤. 牛奶中的抗生素残留及其控制途径［Z］. 乌鲁木齐：乌鲁木齐奶业研究所.
［10］ 何士敏，魏庆梅，李盛贤．牛奶中青霉素含量的快速检测［J］．中国奶品工业，2000，(6):36～37.